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讓膜蛋白結晶觸手可及
您是第位閱讀本文??發布時間:2016/9/19 15:09:52

    完整的膜蛋白如G蛋白偶聯受體(GPCR)和離子通道,是參與細胞信號通路、細胞穩態和人類疾病的關鍵分子;大約三分之一已批準的藥物靶定了這些蛋白。因此,獲得膜蛋白的高分辨率結構信息,以便與分子和細胞數據互補,對科學界和藥物開發行業相當重要。

    眾所周知,膜蛋白很難純化和結晶,因為它們在天然脂雙層之外的環境中不穩定,容易沉淀。正因為如此,使用水溶液的結晶學傳統方法不適合它們的重新溶解。在1996年,科研人員開發出一種in meso脂立方相(LCP)技術,實現了細菌視紫紅質的結晶1,從那以后也徹底改變了膜蛋白的結晶過程。這種方法為膜蛋白的成核和生長提供了一個框架,從而促進了結晶。

    LCP結晶是通過兩個步驟開展的。首先,蛋白與脂類混合,自發形成脂立方相,產生了果凍狀的高粘稠物質。為了加強結晶,還添加了添加劑和沉淀物,取決于不同條件,結晶一般在數日或數周出現。

    結晶試驗通常包括在樣品上試驗的大量條件。高效的結晶試驗不僅需要盡可能降低樣品體積,以確保寶貴蛋白的最大限度利用,還需要自動化開展,以便減少艱苦的體力勞動并加速平板制備過程。自動化減少了手動移液的誤差,并確保了樣品均一性。
 
    目前與LCP方法相關的多個技術問題為此過程的自動化帶來了挑戰。然而,主要問題在于很難準確處理小體積且極為粘稠的立方相材料,直到最近,這一問題才成功解決。

脂類/蛋白相的混合和處理
  
    蛋白和脂類的混合問題是由Martin Caffrey成功解決的,這位科學家目前在都柏林的圣三一學院,他開發出一種方法來連接兩個注射器,一個含有脂類,而另一個含有蛋白,這兩個注射器由體積連接器相連。注射器之間蛋白和脂類的來回反復混合使得脂立方中間相形成2。

   mosquito? LCP移液設備旨在將LCP材料和篩選緩沖液的納升級分液過程自動化。它是通過TTP LabTech、Gebhard Schertler和Pat Edwards之間的合作項目而開發的。

    通過一個可選的LCP混合器,mosquito? LCP為in meso(LCP)技術提供了一個全自動的方案,從而顯著提高了設置篩選平板的速度。準確分配納升級LCP溶液的能力,其體積比手動方法要小得多,節省了寶貴的樣品,實現了更多篩選條件的評估。

LCP分液準確性和重復性

    mosquito? LCP的可靠性是基于其注射器分液臂和mosquito移液器吸頭準確分配LCP液滴和篩選溶液的能力,確保了液滴體積和位置的一致,從而避免了手動誤差。

    mosquito? LCP融合了已被廣泛接受的mosquito? Crystal的特征和功能,將mosquito移液頭與微注射器分液器相結合,能將25-2000 nl的LCP材料準確分配至載玻片或市售的平板上。mosquito? LCP與所有SBS形式的平板兼容,包括最近由Schertler小組和SWISSCI開發的LCP平板,它能實現晶體的高效成像。

   mosquito? LCP分配體積的分析證明了它的高準確性,對于低至25 nl的體積,誤差小于10%。圖1表明,對于所有檢測的體積,液滴體積的變異系數(CV)百分比小于10%,且隨體積增加而逐漸降低。

    每孔中液滴的精確和重復定位(在5 μm之內)確保了LCP液滴頂部的準確緩沖液覆蓋以及膜蛋白晶體的高效成像(圖2)。一旦分配了LCP液滴(圖2a),會迅速地將沉淀劑直接加在這些液滴上,讓它們暴露在空氣和環境影響中的時間縮短至2秒以內(圖2b)。

圖1 | mosquito? LCP注射器的分液準確性變化小于10%。在膜蛋白結晶常用的100 μl體積,其準確性提高至6%。

圖2 | 利用TTP LabTech的mosquito? LCP精確且重復地放置每孔中的液滴。(a) 正向置換注射器泵將50 nl LCP液滴分配至96孔板中,且在5 μm之內。(b) 利用mosquito一次性吸頭將納升級的沉淀劑以列形式快速分配至LCP液滴上,從而減少了LCP液滴在空氣和環境影響中的暴露。

沉淀和結晶

    在優化結晶過程的篩選階段,一個準確的自動化移液系統的真正好處變得明顯。在此階段要研究各種添加劑(如去垢劑、有機物、鹽)和市售的沉淀劑,以確定晶體形成的最佳條件。

    mosquito Crystal、mosquito? LCP臂和移液頭的組合實現了全自動的LCP液滴、添加劑和沉淀劑分配,讓96孔板的設置可在5分鐘內完成,且獨特的正向置換吸頭允許多次吸取和沉淀劑添加。一次性吸頭保證了零交叉污染,避免了耗時的吸頭洗滌。

    讓整個過程自動化不僅節省了時間和精力,也確保了分配的液體體積和液滴位置的重復性,這對膜蛋白的高效結晶很關鍵。圖3顯示了最近利用TTP LabTech的mosquito? LCP對β-腎上腺素受體的成功結晶,從而實現了這種膜蛋白的高分辨率結構確定。

圖3 | 利用TTP LabTech的mosquito? LCP對β-腎上腺素受體的結晶。(a) LCP設置中的β-腎上腺素受體是在LCP夾心板中以280 nm波長的光成像的。(b) LCP晶體中的β-腎上腺素受體層與膜平面大致垂直。(圖片是由T. Warne、P. Edwards和G. Schertler提供的。)

    就所有蛋白的結晶學而言,環境(溫度和濕度)對潔凈過程的影響至關重要。對于高度敏感的膜蛋白更是如此。TTP LabTech的mosquito? LCP儀器的小巧和穩定不僅確保了它的占地面積很少,還讓科學家能夠將其轉移至環境可控的空間,便于膜蛋白的成功結晶。

1. Landau, E.M. & Rosenbusch, J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14532–14535 (1996).生物通 www.ebiotrade.com
2. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H. & Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids 95, 11–21 (1998).


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